1819. augusztus 25-én született a skóciai Glasgowban egy rendőr és egy szövőnő fiaként. A család nagy szegénységben élt, miután apja elvesztette munkáját, így Pinkerton kádárinasnak állt. A munkások jogaiért küzdő chartista mozgalom tagjaként gyakran került szembe a hatóságokkal, végül körözést adtak ki ellene, ő pedig menyasszonyával Kanadába szökött. Új-Skócia partjai előtt hajótörést szenvedtek, így egy fillér nélkül vetődtek partra. Pinkerton a határon átszökve Chicagóban lett kádár egy szeszfőzdében, majd néhány év múlva egy skót emigránsok lakta kis településen saját vállalkozást indított.
A legenda szerint egy erdőben nézett fa után, amikor rábukkant egy pénzhamisító bandára, amelynek tagjait a helyi seriffel letartóztattatta. A bátor és becsületes fiatalember két helyi vállalkozó támogatásával újabb bandákat leplezett le, s hamarosan ő volt a seriff "félállású" helyettese. Amikor azonban megpályázta a tisztséget, a választáson utolsónak jött be: a helyiek nem tudták megbocsátani neki, hogy rabszolgákat szöktetett át Kanadába.
A kisvárosi politikától megcsömörlött Pinkerton visszaköltözött Chicagóba, ahol jobban méltányolták, több megbízást kapott pénzhamisítók, emberrablások felderítésére. 1850-ben alapította meg nyomozással foglalkozó magáncégét, a cég jelszava "sosem alszunk", jelképe a "mindent látó szem" volt. A cég nem szűkölködött munkában: az akkor még óriási kiterjedésű Vadnyugaton ügyfele lett a két működő szolgáltatás, a posta és a vonat a nem működő harmadik, a rendőrség rovására. Pinkerton és munkatársai hamar hírnevet vívtak ki maguknak kemény és hatékony fellépésükkel, ők voltak az elsők, akik aktákat készítettek a gyanúsítottakról, bűnügyi nyilvántartást hoztak létre, fényképek alapján azonosították a tetteseket és nem riadtak vissza attól sem, hogy beépüljenek a bandákba.
Pinkerton lett Abraham Lincoln elnök testőre, s 1861-ben meghiúsította az elnöki beiktatáson tervezett merényletet. Lincoln hálából őt bízta meg a titkosszolgálat megszervezésével, amelyet E.J. Allen néven vezetett, s amely a polgárháború végén már hatékonyan működött. Pinkertonék hírszerzésben és kémelhárításban is jeleskedtek, megakadályozták például a nyolcezer déli hadifogoly kiszabadítására szőtt összeesküvést. A Vadnyugat legnagyobb "legendáinak" vetettek véget, 1866-ban egy 700 ezer dolláros vonatrablás tetteseit fogták el, ők számolták fel Jesse James bandáját, a Wild Bunchnek nevezett vonat-és bankrablásra szakosodott bűnszövetkezetet, s ők üldözték el Latin-Amerikába Butch Cassidyt és a Sundance Kölyköt.
A cég hírneve egyre nőtt, nyomozóit csak úgy emlegették: a pinkertonok, a lakosság szemében hősökké váltak és ponyvaregények zengték dicsőségüket. A gyorsan növekvő vállalkozás azonban a nyilvánosság elől titkolt, s tulajdonképpen törvényellenesnek számító eszközökkel is dolgozott: megtévesztéssel, megfélemlítéssel, emberrablással, sőt gyilkossággal is. Jesse James és bandája üldözése közben például gyújtóbombát dobtak a bandita anyjának farmjára, a tűzben egy kisgyerek is meghalt. Ugyanekkor vesztette életét Kate Warn, a világ első - a Pinkerton cég alkalmazásában álló - nyomozónője is. Hírnevüket rombolta, hogy gátlás nélkül szegődtek el sztrájkok letörésére is. 1873-1876 között Pinkerton egy ügynöke beépült a Molly Maguire nevű titkos, állítólag terrorakciókra készülő bányászszervezetbe. A szervezkedést leleplezték, vezetőit kivégezték - így lett az egykori munkásmozgalmi aktivistából a kapitalisták érdekeinek védelmezője.
Pinkerton ellensúlyozandó rossz sajtóját, gátlástalan öntömjénezésbe kezdett, személyét és vállalkozását idilli fényben lefestő könyvek hosszú sorát íratta, sőt írta meg. A kicsit kiszínezett, de reklámjuk szerint valódi, "az aktákból átvett" sztorikat tartalmazó történetek nagy hatást gyakoroltak az olvasókra, sőt nemcsak rájuk, de Mark Twainre és Raymond Chandlerre is. Az első amerikai magánnyomozó alakja több filmben is feltűnik, egyebek közt a Lincoln életéről szóló alkotásokban, vagy a Jesse James legendáját feldolgozó, Törvényen kívül című westernben, utóbbiban Timothy Dalton formálta meg alakját.
Pinkerton 1884. július 1-jén halt meg. Az ügynökséget fiai örökölték, akik a múlt század első évtizedeiben külföldi irodákat is nyitottak (ma már a világ több mint száz országában vannak jelen), s akik a nyomozással szemben egyre inkább a biztonsági és védelmi tevékenységre helyezték a súlyt. Az egykori családi vállalkozás azóta részvénytársasággá vált, és kikerült a Pinkertonok ellenőrzése alól.